|
一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的：1. 通過本次實驗的學(xué)習(xí)與操作，使學(xué)生在實驗過程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)測定蛋白質(zhì)純度與分子量的原理與依據(jù);
2. 要求學(xué)生掌握電泳原理以及SDS-PAGE垂直板電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù);
3. 熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，凝膠圖譜的繪制與計算;
4. 了解在電泳中分子量標準物的使用。
內(nèi)容：1.SDS-PAGE電泳的原理：SDS使蛋白質(zhì)的變性作用，以及此實驗中采用的使不連續(xù)PAGE膠(分離膠和濃縮膠)的原理;
2.SDS-PAGE電泳進行純度鑒定的原理：凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān);
3.電泳的操作：制膠、加樣、電泳、撥膠、凝膠染色與脫色;
4.蛋白條帶的觀察以及分子量的估算。
二、實驗儀器與試劑
1.實驗儀器
SDS-PAGE電泳設(shè)備，電爐，脫色搖床
2. 實驗材料及試劑
實驗材料：蛋清(S1)、粗分離樣品(S2)、離子交換層析中穿透峰下降段樣品(S3)、離子交換層析洗脫峰樣品(S4)，橡膠手套
實驗試劑：2×上樣緩沖液、10%SDS、30%丙烯酰胺貯存液、分離膠緩沖液(1.5 mol/LpH8.8 Tris-HCl 緩沖液)、濃縮膠緩沖液(0.5 mol/LpH6.8 Tris-HCl 緩沖液)、10%過硫酸銨(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly電泳緩沖液、1%瓊脂糖溶液、染色液、脫色液
三、實驗步驟
(一)蛋白樣品的處理
取200µL 上述備用蛋白樣品于帶塞的小離心管中，加入200µL 的2×上樣緩沖液，混勻，輕輕蓋上蓋子，封口膜封緊瓶口以免加熱時迸出，在100℃沸水浴中加熱3～5min，取出后10000r/min 離心10min，取上清待用。
(二)SDS-PADE實驗步驟(適用于大板，若為天能公司的小板，參考附錄中的方法)
1.電泳玻璃板洗凈，并把玻璃板在灌膠支架上固定好。( 試樣格(梳子)臨用前用無水乙醇擦拭，讓其揮發(fā)至干。)
2.用電泳緩沖液配制1%的瓊脂糖凝膠，煮沸溶解后冷卻至55℃左右，加入制板槽槽內(nèi)封板。(固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.)
3.按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5cm左右，之后加少許蒸餾水，靜置30分鐘。(凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。)
4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入樣梳，靜置25分鐘。(樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。)
5.拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液，沒過鋸齒時可拆去底端的瓊脂糖。(要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.)
6.加樣5個，空出第一個孔，從第二個開始按已編排好的順序依次加入相應(yīng)體積的樣品和蛋白Marker。其中蛋清(S1)和Marker加樣量為2µL，S1、S2、S3、和S4加樣量為10µL。為了練習(xí)和比較上樣量的影響，可以加20µL的S1～S4作為對照(注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下沉?xí)r會發(fā)生擴散。為避免邊緣效應(yīng)，最好選用中部的孔注樣。)
7.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電壓恒定在160V，當進入分離膠后改為240V，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。
8.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，用專用工具撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，然后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，42℃染色40min左右。(剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分。)
9.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。
10.將凝膠室溫保存于10%甘油水溶液中，至凝膠掃描分析。
11.凝膠掃描儀掃描并進行數(shù)據(jù)分析,求出溶菌酶的相對分子質(zhì)量。分析各樣品中溶菌酶相對含量的變化。
|
